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江苑生物：慢病毒滴度測定方法、步驟和原理全攻略

經純化和濃縮的慢病毒建議先進行滴度測定，再用于感染目的細胞。常用的慢病毒滴度測定方法有4種，分別是：

(1) 熒光計數法

(2) 定量PCR法檢測整合到基因組DNA中的病毒序列

(3) p24蛋白ELISA試劑盒檢測法

(4) qRT-PCR試劑盒檢測法檢測病毒樣本中的基因組拷貝數

前兩種方法檢測的是病毒活性滴度，需要用病毒感染細胞，檢測過程一般需要5~10天；后兩種方法檢測的是病毒的物理滴度（即不能區分有感染能力的病毒顆粒和無感染活性的死病毒），可以在1~2天內完成。需要說明的是：滴度檢測方法不同，病毒滴度值可能有所差異。

活性滴度：TU/mL，指每毫升中含有的具有生物活性的病毒顆粒數。「TU」為「transducing units」的縮寫，中文為「轉導單位」，表示可以感染并進入到靶細胞中的病毒基因組數。

若用慢病毒建立普通的過表達、敲除和敲降等細胞系，可以用抗生素或者流式篩選出陽性細胞，對滴度要求并不嚴格，測物理滴度和活性滴度均可。在一些比較嚴格實驗中，比如用慢病毒做RNAi-screening或CRISPR-screening，需要嚴格控制MOI，就需要測定慢病毒的活性滴度。

1. 熒光計數法測定滴度的操作方法

(1) 測定前，將生長狀態良好的293T細胞鋪入96孔板，每個孔加5×10³個細胞，體積為100 μL。（江苑生物用的293T細胞，也可以使用其他易感染細胞，如H1299、HT1080細胞等，但用不同細胞標定的滴度值會有所差異）。

(2) 感染前，對待檢測的病毒樣品進行10倍的梯度稀釋。操作方法為：準備8個無菌的EP管，每個管子中加入90μL細胞培養基，取待測定的病毒樣品10 μL加入到個管中，混勻后，取10 μL加入到第二個管中混勻，繼續相同的操作直到最后一管。（每個梯度可多做復孔，減少實驗誤差）。

(3) 選取所需的細胞孔，吸去96孔板中原有的培養基，加入90 μL稀釋好的病毒溶液，并做好標記。放入培養箱培養，小心操作，不要吹起細胞。培養過程中適當更換培養基以維持細胞正常生長。

(4) 37℃，5% CO₂培養48小時后，加入新鮮培養基100 μL，再經過24小時候，更換新鮮培養基150 μL。（小心操作，避免細胞被吹起）

(5) 96小時后，觀察熒光表達情況，統計熒光細胞個數。若病毒本身只帶有Puromycin篩選抗性，則感染后48小時加入抗性藥物Puromycin，維持藥物濃度在5 μg/mL。繼續培養2天，觀察細胞生長狀況，計算具有抗性的細胞數。

滴度的計算：

用熒光顯微鏡對熒光陽性細胞進行計數，數出最后一個能觀察到熒光的孔內的熒光細胞數，熒光細胞數除以病毒原液量即為該病毒的滴度。

根據下述熒光圖片中GFP表達情況，在加入10^-6 μL病毒原液的孔中觀察到2個帶有熒光的細胞，說明該孔中至少有2個病毒顆粒感染了細胞，則該病毒的滴度等于帶有熒光的細胞數除以病毒原液量，本例子中就是2/(10^-6)=2×10⁶，單位為TU/μL，也就等于2×10⁹ TU/mL。

該方法還可以用于檢測帶有Puromycin抗性標記的慢病毒的滴度（根據Puromycin抗性培養基下活細胞的數量來判斷），如果在加入10^-5 μL病毒原液的孔中觀察到3個細胞存活，說明該孔中至少有3個病毒顆粒感染了細胞，則該病毒的滴度等于活的細胞數除以病毒原液量，即3/(10^-5)=3×10⁵，單位為 TU/μL，也就等于3×10⁸ TU/mL。

圖1. 一組孔稀釋法滴度測定過程中病毒感染293T細胞后的熒光照片（僅供參考）

2. 定量PCR法檢測整合到基因組DNA中的病毒序列

(1) 樣品制備

(a) 檢測前，對293T細胞傳代，每個24孔中加1×10⁵個細胞，體積為500 μL；

(b) 按照上述類似方法10倍梯度稀釋樣品；

(c) 選取所需的細胞孔，吸去90 μL培養基。加90 μL入稀釋好的病毒溶液。放入37℃ 5% CO₂培養箱中培養；留一組不用病毒處理，作為Control組；

(d) 48小時后，加入新鮮培養基500 μL。小心操作，不要吹起細胞；

(e) 4天后，抽提RNA準備做RT-qPCR。

(2) RNA逆轉錄獲cDNA。

(3) 定量PCR檢測，同時以Actin作為內參基因。

示例: 定量PCR法測定慢病毒滴度（目的慢病毒中含有GFP基因序列，Control組中不含有GFP序列，檢測過程以針對GFP序列設計擴增引物，同時以Actin作為內參），擴增曲線圖參見圖2。

圖2. 定量PCR曲線圖（僅供參考）

表1. 定量PCR檢測數據（僅供參考）

注：曲線顏色和樣品顏色相同

滴度計算：

通過比較Control組和試驗組的Ct值差異判斷滴度值。Control組無GFP序列，故Ct值較大。通常情況下，認為Ct值差異2以上存在顯著差異。即若試驗組Ct值小于Control組Ct值超過2，則試驗組與Control組存在顯著差異，即試驗組具有GFP序列。

反轉錄反應所獲得的20 μL cDNA中只取了1 μL用于實時定量檢測，所以該結果僅表示1/20樣品的情況，所以在滴度計算時應該乘以系數20。

在本次滴度檢測中，10^-5 μL組樣品檢測到目的基因GFP的表達，且與Control組間Ct值差異明顯（Ct值相差3左右），所以認為在10^-5 μL組樣品中存在病毒顆粒。假定該組樣品含有至少有1個病毒顆粒，則病毒的滴度為：

1/(10^-5 μL) ×20＝2×10⁶ TU/μL=2×10⁹ TU/mL

滴度值： >2×10⁹ TU/mL

3. p24蛋白ELSIA試劑盒法測定慢病毒滴度

檢測原理：采用固相酶聯免疫吸附分析法（Enzyme-linked Immunosorbent Assay，ELISA）檢測樣品中的HIV-1 p24抗原。慢病毒樣品中HIV-1 p24抗原與固相抗-p24單克隆抗體和生物素標記的抗-p24多克隆抗體通過免疫反應，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素復合物；然后加入HRP（Horseradish Peroxidase，辣根過氧化物酶）標記的鏈親和素，形成固相抗-p24單克隆抗體—p24抗原—抗-p24多克隆抗體-生物素—鏈親和素-HRP復合物；加入TMB-H₂O₂底物溶液，HRP催化H₂O₂氧化TMB生成藍色的產物（更大吸收峰655nm），加入終止液終止酶催化反應，生成黃色產物（更大吸收峰450nm）。其吸光度與校準品和樣品中的HIV-1 p24抗原濃度成正相關。通過建立標準樣品曲線可得出樣品中 HIV-1 p24抗原濃度。

其主要步驟為（詳細方法參見市售的p24 ELISA試劑盒）：

(1) 樣品準備和稀釋

(2) 標準曲線樣品制備

(3) 樣品檢測

(4) 檢測數據分析

值得注意的是，該方法最終得出的樣品中p24蛋白的含量，單位為pg/mL，是物理單位。

要區別于活性單位TU/mL，因此，采用不同方法檢測的病毒滴度在病毒感染細胞時根據滴度需要加入的病毒量也有所差異。

4. qRT-PCR試劑盒檢測病毒樣本中的基因組拷貝數

檢測原理：用特異性引物能夠對以HIV-1為結構基礎的慢病毒樣品的RNA基因組的保守序列進行特異性擴增，通過qRT-PCR對產物進行實時監測。用標準品擴增得到的CT值繪制標準曲線，將待測病毒樣本反應的C_T值帶入標準曲線，計算得到病毒樣本中的RNA 基因組拷貝數，即病毒顆粒數（copies/mL）。

關于qRT-PCR法測定病毒樣品中RNA的方法操作步驟詳細請參考對應的試劑盒說明書。